MPSeqM, un outil combinant la PCR multiplex et le séquençage à haut débit pour étudier le polymorphisme de huit gènes d'avirulence de L. maculans et son application aux populations naturelles

Référence :
Gautier, A., Laval, V. & Balesdent, MH. MPSeqM, a tool combining multiplex PCR and high-throughput sequencing to study the polymorphism of eight Leptosphaeria maculans avirulence genes and its application to field surveys in France. BMC Microbiol 25, 159 (2025). https://doi.org/10.1186/s12866-025-03855-2

Contexte :
Leptosphaeria maculans est un champignon pathogène responsable de la nécrose du collet du colza (Brassica napus). La maladie est principalement contrôlée par le déploiement de variétés dotées de gènes de résistance majeurs (Rlm). Les gènes Rlm peuvent rapidement devenir inefficaces à la suite de la sélection d'isolats virulents du champignon, c'est-à-dire avec des mutations, y compris des délétions, dans les gènes d'avirulence correspondants (AvrLm). La gestion raisonnée et durable des gènes Rlm repose sur la détection et la surveillance des isolats virulents dans les populations de terrain. Sur la base des connaissances antérieures sur le polymorphisme des gènes AvrLm, nous avons développé un outil combinant la PCR multiplex et le séquençage Illumina pour caractériser les variants alléliques de huit gènes AvrLm dans les populations de L. maculans.

Résultats :
Nous avons testé la méthode sur des pools d'ADN de 71 isolats caractérisés de L. maculans et sur des taches foliaires (macules) de 32 isolats de L. maculans. Après multiplex-PCR et séquençage avec la technologie MiSeq, les séquences ont été mises en correspondance avec une base de données de séquences AvrLm. Les données ont été filtrées à l'aide de seuils définis à partir d'échantillons contrôles inclus dans chaque série de séquençage. Les proportions de chaque variant allélique par gène, y compris les délétions, sont en parfaite corrélation avec les proportions attendues. La méthode a ensuite été appliquée à environ 1300 symptômes (42 pools de 32 macules principalement) provenant de neuf champs de B. napus. Les proportions d'isolats virulents estimées par le séquençage des pools de macules étaient en parfaite corrélation avec celles estimées par le pathotypage d'isolats individuels. En outre, les proportions de variants alléliques déterminées à l'échelle nationale sont également en corrélation avec celles déterminées précédemment à la suite du séquençage individuel des gènes AvrLm dans une collection représentative d'isolats. Enfin, la méthode nous a également permis de détecter des variants alléliques encore non décrits et rares.

Conclusions :
Malgré la diversité des mécanismes générant des isolats virulents et la diversité gène-dépendante du polymorphisme des gènes AvrLm, la méthode s'est avérée adaptée à la surveillance régulière et à grande échelle des populations de L. maculans, ce qui facilitera le déploiement d'un système de surveillance de gènes Rlm à grande échelle efficace et la détection précoce des contournements de résistance.