Cette thèse à été encadrée par Sabine Fillinger et le jury était composé de :

Thomas GUILLEMETTE
Professeur des universités,                              Rapporteur & Examinateur
Université d'Angers 
Guilhem JANBON
Directeur de recherche,                                    Rapporteur & Examinateur
Institut Pasteur 
Marie DUFRESNE
Professeure des universités,                            Examinatrice
Université Paris Saclay 
Florence LECLERC
Professeure des universités,                            Examinatrice
Université Paris 
Cécile LORRAIN
Junior group leader,                                          Examinatrice
ETH Zurich 

Résumé en français :
Les pathogènes fongiques résistants à de multiples traitements antifongiques représentent un risque majeur pour la santé humaine et végétale. Plusieurs études montrent l’importance de prévenir la généralisation de la résistance multi-drogue (MDR) qui repose entre autres sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués tels que la régulation de la transcription. Chez les pathogènes humains comme agricoles, la MDR est souvent liée à l'efflux accru des molécules antifongiques en dehors des cellules. C’est le cas chez le pathogène du blé Zymoseptoria tritici agent de la septoriose, où la surexpression du gène MFS1 codant une pompe à protons est responsable du phénotype MDR. Cette surexpression est directement liée à la présence d’inserts dans le promoteur de MFS1 (PMFS1), les inserts I, II ou III identifiés auparavant. D’autres inserts retrouvés dans PMFS1 ne conduisent pas nécessairement à la MDR. Ainsi, l’une des questions au début de cette thèse concernait les mécanismes moléculaires responsables de la surexpression de MFS1 et, plus largement, de la MDR chez Z. tritici. Quels motifs de régulation propres aux inserts I-III sont nécessaires à la surexpression de MFS1 ? Quels sont les facteurs de transcription impliqués ? Existe-t-il d’autres mécanismes en dehors de la surexpression de MFS1 ? Nous avons étudié des populations MDR contemporaines européennes de Z. tritici afin de corréler les différents génotypes de PMFS1 aux différents phénotypes MDR observés. Nos résultats montrent que 1/ le promoteur de MFS1 est un hot-spot d'insertion avec 13 inserts différents répartis sur 7 loci ; 2/ parmi les 13 inserts, 12 seraient issus d’événements de transposition ; 3/ seuls 6 inserts sont liés au phénotype MDR ; 4/ la résistance multi-drogue chez Z. tritici n'est pas uniquement liée au promoteur de MFS1 ; d'autres mécanismes sont impliqués dans le phénotype MDR. Dans un second temps, nous avons examiné l'implication des inserts I-III et de différents motifs potentiels de régulation trouvés dans ces inserts dans la surexpression de MFS1 au moyen de fusions transcriptionnelles avec le gène rapporteur de la RFP. Les motifs potentiels analysés étaient ceux énoncés par Omrane et al. (2017) ; les motifs MCB dans les inserts de type I et les motifs HNF3 dans les inserts de type IIA. Ces motifs ont été délétés ou remplacés par des séquences neutres dans leurs inserts respectifs afin d’évaluer leur rôle dans la surexpression de MFS1. Nous avons pu ainsi montrer que la surexpression de MFS1 et, de ce fait, la MDR est due aux séquences spécifiques des inserts I, II et III. Dans les inserts de type I, les motifs MCB contribuent bien à la surexpression de MFS1 mais ne sont pas les seuls éléments cis impliqués. Dans les inserts de type II, les motifs HNF3 ne sont pas responsables de la surexpression de MFS1. D’autres motifs de régulation potentiels ont été identifiés dans la séquence de PMFS1 et dans les inserts I-III. Les fusions transcriptionnelles PMFS1-RFP construites permettront de poursuivre la caractérisation des acteurs moléculaires impliqués dans la surexpression de MFS1. Ainsi, nous faisons le constat que la MDR est le résultat de plusieurs mécanismes génétiques qui ne sont pas uniquement liés au promoteur MFS1, et nous montrons que le promoteur MFS1 peut accueillir une multitude d'inserts qui ne seront pas forcément liés à la MDR. Estimer la MDR chez Z. tritici par la seule détection d'inserts dans le promoteur MFS1 peut fausser les estimations. Nous suggérons de réaliser la détection et le suivi de la MDR au champ, au moyen de tests phénotypiques. La détection moléculaire au champ de la MDR nécessiterait d’identifier de façon exhaustive les mécanismes moléculaires impliqués. Les outils d’analyse de l’expression et les ressources microbiologiques générés durant ces travaux permettent d’ouvrir la voie à l’identification de ces éléments.

Résumé en anglais:
Fungal pathogens resistant to multiple antifungal treatments pose a major risk to human and plant health. Several studies highlight the importance of preventing the spread of multi-drug resistance (MDR), which relies, among other factors, on understanding the molecular mechanisms involved, such as transcriptional regulation. In both human and agricultural pathogens, MDR is often associated with increased efflux of antifungal molecules outside the cells. This is the case with the wheat pathogen Zymoseptoria tritici, the causal agent of septoria leaf blotch, where overexpression of the MFS1 gene encoding a proton pump is responsible for the MDR phenotype. This overexpression is directly linked to the presence of inserts in the MFS1 promoter (PMFS1), namely inserts I, II, or III identified previously. Other inserts found in PMFS1 do not necessarily lead to MDR. Thus, one of the questions at the beginning of this thesis concerned the molecular mechanisms responsible for the overexpression of MFS1 and, more broadly, for MDR in Z. tritici. What regulatory motifs specific to inserts I-III are necessary for the overexpression of MFS1? What transcription factors are involved? Are there other mechanisms besides MFS1 overexpression? We studied contemporary MDR populations of Z. tritici in Europe to correlate different PMFS1 genotypes with observed MDR phenotypes. Our results show that: 1/ the MFS1 promoter is a hotspot for insertion with 13 different inserts distributed over 7 loci; 2/ among the 13 inserts, 12 are likely derived from transposition events; 3/ only 6 inserts are linked to the MDR phenotype; 4/ multi-drug resistance in Z. tritici is not solely linked to the MFS1 promoter; other mechanisms are involved in the MDR phenotype. Secondly, we examined the involvement of inserts I-III and different potential regulatory motifs found in these inserts in MFS1 overexpression using transcriptional fusions with the RFP reporter gene. The potential motifs analyzed were those stated by Omrane et al. (2017); the MCB motifs in type I inserts and the HNF3 motifs in type IIA inserts. These motifs were deleted or replaced by neutral sequences in their respective inserts to assess their role in MFS1 overexpression. We were able to show that MFS1 overexpression and, consequently, MDR are due to specific sequences of inserts I, II, and III. In type I inserts, MCB motifs indeed contribute to MFS1 overexpression but are not the only cis elements involved. In type II inserts, HNF3 motifs are not responsible for MFS1 overexpression. Other potential regulatory motifs were identified in the PMFS1 sequence and in inserts I-III. The PMFS1-RFP transcriptional fusions constructed will allow further characterization of the molecular players involved in MFS1 overexpression. Thus, we conclude that MDR results from several genetic mechanisms that are not solely linked to the MFS1 promoter, and we show that the MFS1 promoter can accommodate a multitude of inserts that may not necessarily be linked to MDR. Estimating MDR in Z. tritici solely based on detecting inserts in the MFS1 promoter can lead to inaccurate estimations. We suggest conducting MDR detection and monitoring in the field through phenotypic tests. Molecular detection of MDR in the field would require exhaustive identification of the molecular mechanisms involved. The expression analysis tools and microbiological resources generated during this work pave the way for the identification of these elements.